index.Rmd

---
title       : Kasvajaviirused
subtitle    : Onkobioloogia
author      : Taavi Päll<br>lektor, Tallinna Tehnikaülikool
output:
  xaringan::moon_reader:
    lib_dir: libs
    nature:
      highlightStyle: github
      highlightLines: true
      countIncrementalSlides: false
background-image: url(http://33.media.tumblr.com/tumblr_m5tnjt5vDR1qbz9meo1_500.jpg)
---


```{r setup, include=FALSE}
options(htmltools.dir.version = FALSE)
knitr::opts_chunk$set(echo = FALSE, fig.align='center', message = FALSE, warning = FALSE)
```

background-image: url(http://33.media.tumblr.com/tumblr_m5tnjt5vDR1qbz9meo1_500.jpg)

---
class: inverse, center, middle
# Tuumorviiruste avastamine

---

# Lindude leukeemia viraalne ülekanne

.pull-left[
- 1908 aastal näitasid Taani teadlased **Vilhelm Ellerman** (1871-1924) ja **Oluf Bang** (1881-1937) et **lindude leukeemia** (*avian viral leukemia*) kandub viraalsel teel üle.
- viraalsel teel tähendas antud kontekstis, et nad isoleerisid filtreeritava agendi erütro-müeloblastilist leukeemiat põdevate kanade vererakkudest.
- See leid ei tekitanud sellel ajal mingit tähelepanu, lisaks ei peetud tollal erütro-müeloblastilist leukeemiat ka vähiks.
]

.pull-right[
```{r}
knitr::include_graphics("http://www.nature.com/nrc/journal/v10/n12/images/nrc2961-f1.jpg")
```


]

---

# Rousi kana sarkoomi mudeli skeem

- 1909-11 aastatel katsetas **Francis Peyton Rous** (1879-1970) talle uurimiseks toodud **kana sarkoomiga** ja leidis et tuumorit on võimalik kanadel üle kanda vähirakkudest sõltumatult.


```{r}
knitr::include_graphics("http://o.quizlet.com/wwG.Q0fCHg8IoXzObiRWeg.png")
```


.footer[Pilt: The Biology of Cancer. Garland Science.]

---

# Rous pälvis selle töö eest 1966 aastal Nobeli preemia

```{r, out.height=300}
knitr::include_graphics("http://cancerbio.files.wordpress.com/2011/05/peyton-rous.jpg")
```

---

## Peale esialgseid avastusi oli onkoviiruste alal tükk aega vaikus

- 1930-ndatel kirjeldati Richard E. Shope (1901-1966) and E. Weston Hursti (1900-1980) poolt **küülikute papilloomiviirus** ja John Joseph Bittneri poolt (1904-1961) **hiirte piimanäärme viirus** (*mouse mammary tumor virus*, *MMTV*).

- 1950-ndatel avastati Ludwig Grossi (1904-1999) poolt **hiirte leukeemiaviirus** (retroviirus) ja **hiirte polüoomiviirus**

---

# Vähk võib olla nakkav

.pull-left[
```{r}
knitr::include_graphics("http://33.media.tumblr.com/tumblr_m5tnjt5vDR1qbz9meo1_500.jpg")
```

]

.pull-right[
Möödunud sajandi 50-ndatel aastatel, kui oli hiirte peal leitud seosed leukeemia ja viirusnakkuse vahel, tekkis **hüpotees, et vähk on viirushaigus**.]

---
class: inverse, center, middle

# Viirused põhjustavad rakkude transformatsiooni

---

# Rousi sarkoomiviirus muudab fibroblaste

1950-ndate lõpus ja 1960-ndatel uurisid Harry Rubin ja Howard Temin **Rousi sarkoomiviirust (RSV)** koekultuuris, kasutades kana fibroblaste (CEF)

.pull-left[

```{r}
knitr::include_graphics("http://o.quizlet.com/6TOz6bZnsMrOKfaPM2MXXQ.png")
```
]

.pull-right[
- RSV nakatatud CEF-id moodustavad **kolooniad** (*foci/clusters*)
- kolooniaid moodustavad rakud on muutunud morfoloogiaga (**trasformeerunud**)
- sarnanevad sarkoomi rakkudega
]

---

# Transformeerunud rakkude iseloomulikud omadused

- Kontaktinhibitsiooni kadumine
- Sõltumatus adhesioonist (*anchorage independence*) -- rakud kasvavad mitmes kihis
- Poolduvad ~lõpmatult (immortaliseerumine)
- Sõltumatus kasvufaktoritest, rakkude jagunemine ei arresteeru kasvufaktorite eemaldamisel
- Kõrge gükoositransport
- Tumorigeensus: moodustavad peremees-loomas tuumoreid 


---

# Vähki indutseeriva toimega on väga erinevad viirused

```{r}
vir <- readr::read_delim("Tuumorviirus | Viirusperekond | Genoomi suurus (kb)
DNA viirused | | 
B-hepatiidi viirus (HBV) | Hepadnaviridae | 3
SV40/polüoomi viirus | Polyomaviridae | 5
inimese papilloomiviirus 16 (HPV) | Papillomaviridae | 8
inimese adenoviirus 5 | Adenoviridae | 35
inimese herpesviirus 8 (HSV-8; KSHV) | Herpesviridae | 165
Shope fibroomiviirus | Poxviridae | 160
RNA viirused | | 
Rousi sarkoomiviirus (RSV) | Retroviridae | 9
inimese T-raku leukeemia viirus (HTLV-I) | Retroviridae | 9", delim = "|")
virtab <- knitr::kable(vir, format = "html")
kableExtra::kable_styling(virtab, "striped", position = "left", font_size = 12)
```


---
class: inverse, center, middle

> Inimesel otsiti vähkidest pikalt RSV sarnast lihtsat retroviirust, kuid vähiga seoses leiti ainult komplekssed retroviirused nagu HTLV-I ja HIV-1/-2.

---

# Seitse viirust

- Praegusel ajal hinnatakse, et viirused vastutavad 10-15% vähijuhtumite eest maailmas. 
- **Inimestel on leitud seitsmel viirusel seos vähi tekkega.**

```{r}
knitr::include_graphics("http://imgs.xkcd.com/comics/seven.png")
```


---

# Inimese kasvajaviirused

```{r}
vir <- readr::read_delim("Viirus | Genoom | Kasvaja | Esmakirjeldus 
Epstein-Barr viirus (EBV; human herpesvirus 4) | dsDNA herpesviirus | Burkitt'i lümfoom | 1964 
B-hepatiidi viirus (HBV) | ss/dsDNA hepadenoviirus | maksa kartsinoomid | 1965
inimese T-lümfotroopne viirus I (HTLV-I) | pluss-ahelaline ssRNA retroviirus | T-rakuline leukeemia | 1980
inimese papilloomiviirused (HPV) 16 ja -18 | dsDNA papilloomiviirus | emakakaela vähk, peenisekasvajad, anogenitaal- ja  pea-kaela kasvajad | 1983-84
C-hepatiidi viirus (HCV) | pluss-ahelaline ssRNA flaviviirus | maksa kartsinoomid ja lümfoomid | 1989
Kaposi sarkoomi herpesviirus (KSHV; human herpesvirus 8) | dsDNA herpesviirus | Kaposi sarkoom, kehaõõne-lümfoom | 1994
Merkeli rakkude polüoomiviirus | dsDNA polüoomiviirus | Merkeli rakkude kartsinoom | 2008", delim = "|")
virtab <- knitr::kable(vir, format = "html")
kableExtra::kable_styling(virtab, "striped", position = "left", font_size = 12)
```

---
class: inverse, center, middle

> Inimese kasvajaviirused on kõik eri klassidest ja hõlmavad kogu viirus-spektrit

---

# Epstein-Barri viirus (EBV)

- EBV partiklid avastati elektronmikroskoopia teel nn. **Aafrika Burkitti lümfoomi (BL)** patsientidel.
- EBV on laialt levinud ekvatoriaal Aafrikas ja Paapua Uus-Guineas. 
    - Ainult 2.3% lümfoomidest on BL-d. 
    - ~100% patsientidest nakatunud.
    - võib kaasneda malaariast või kollapalavikust tingitud immuunpuudulikkusega.
- EBV negatiivne **sporaadiline BL** esineb arenenud maades.
    - Sporaadiline BL sisaldab iseloomulikke MYC translokatsioone.


```{r, out.width=260, fig.cap="Pilt: By Ed Uthman, MD. [Public domain], <a href='https://commons.wikimedia.org/wiki/File%3ABurkitt_lymphoma%2C_touch_prep%2C_Wright_stain.jpg'>via Wikimedia Commons</a>"}
knitr::include_graphics("https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/4/4c/Burkitt_lymphoma%2C_touch_prep%2C_Wright_stain.jpg")
```

.footer[

]

---
## Kasvajates reeglina viiruspartikleid ei leita

- Lisaks EBV-le on veel ainult üks inimese onkoviirus (T-lümfotroopne viirus I, HTLV-I) tuumorites kirjeldatud kasutades klassikalisi viroloogi töövahendeid: mikroskoopi ja viiruskultuuri.
- B hepatiidi seos maksakartsinoomiga tehti kindlaks 22707 Taiwani meest hõlmavas populatsiooniuuringus.
- HPV-16/18 (all pildil kõige parempoolne HPV16 hübridisatsioon CIN), C hepatiidi, Kaposi sarkoomi ja Merkeli rakkude polüoomiviirus identifitseeriti kasvajates molekulaarbioloogia meetodeid kasutades.

```{r}
knitr::include_graphics("https://www.ncbi.nlm.nih.gov/corecgi/tileshop/tileshop.fcgi?p=PMC3&id=789917&s=6&r=1&c=1")
```

---

# HPV ja emakakaelavähk

- 1980-ndatel oli teada, et inimese papilloomiviirused põhjustavad kondüloomide (*genital warts*) teket.
-  Selle põhal oletas Harald zur Hausen, et HPV võib olla seotud ka emakakaela vähi tekkega.
- Oma hüpoteesi kontrollimiseks **hübridiseeris ta papilloomiviiruse DNA emakakaelavähi DNA-le.**


```{r, fig.height=3, fig.width=8, dev='svg'}
library(dplyr)
library(purrr)
library(jsonlite)
library(ggplot2)
library(gridExtra)
library(ggthemes)

# Anogenitaalsed tüükad (A63.0)
nh04 <- boulder::json_to_df("data/NH04.json")
pk30 <- boulder::json_to_df("data/PK30.json")

mut_vanus <- function(x){
  strsplit(x, split = "-") %>% 
    unlist() %>% 
    sub("\\+", "", .) %>% 
    as.numeric() %>% 
    min()
}

nh04filt <- select(nh04, Aasta, Sugu, Vanuserühm, value) %>% 
  filter(complete.cases(.))
pk30filt <- select(pk30, Aasta, Sugu, Vanuserühm, value) %>% 
  filter(complete.cases(.))

nh04filt <- nh04filt %>% 
  mutate(Vanuserühm = as.character(Vanuserühm),
         Vanuserühm = map_dbl(Vanuserühm, mut_vanus))

pk30filt <- pk30filt %>% 
  mutate(Vanuserühm = as.character(Vanuserühm),
         Vanuserühm = map_dbl(Vanuserühm, mut_vanus))

nh04sum <- group_by(nh04filt, Vanuserühm, Sugu) %>% 
  summarise(Juhud = mean(value, na.rm = T))
pk30sum <- group_by(pk30filt, Vanuserühm, Sugu) %>% 
  summarise(Juhud = mean(value, na.rm = T))

p <- ggplot(nh04sum, aes(Vanuserühm, Juhud, colour = Sugu, group = Sugu)) +
  geom_point() +
  geom_line() +
  ggtitle(unique(nh04$Nakkushaigus),
          paste(range(as.character(nh04$Aasta)), collapse = " - ")) +
  scale_color_colorblind() +
  theme(legend.position = c(0.75,0.75),
        legend.background = element_blank(),
        legend.title = element_blank())

q <- ggplot(pk30sum, aes(Vanuserühm, Juhud, group = 1)) +
  geom_point() +
  geom_line() +
  ggtitle("Emakakaela vähk (C53)",
          paste(range(as.character(pk30$Aasta)), collapse = " - ")) +
  ylab("Intsidents 100 000 inimese kohta") +
  scale_color_colorblind()

grid.arrange(p, q, nrow = 1)
```

.footer[
Graafiku andmed: Tervisestatistika ja terviseuuringute andmebaas. [Tervise arengu instituut](http://pxweb.tai.ee/PXWeb2015/index.html).
]

---
# Kaposi sarkoom ja AIDS

Enne AIDSi epideemiat oli Kaposi sarkoom maailmas üliharuldane.

```{r}
knitr::include_graphics("http://1.bp.blogspot.com/-kY9S0A0KJkQ/TY0pqUgWCGI/AAAAAAAAA_M/hyT-Z9YJDhw/ht_philadelphia_051209_ssh.jpg")
```

HIV ise ei ole tumorigeenne, kuid loob immuunpuudulikkuse näol keskkonna kasvaja-viiruste "kapist välja" tulemiseks.

---
class: inverse, center, middle

# Viiruste vähimehhanismid

---

# Viirused põhjustavad kasvajaid mitut moodi

Mehhanismid langevad kahte laia kategooriasse.

- **otsene mehhanism: insertsiooniline mutagenees**, onkviirused nakatavad normaalseid rakke ja integreeruvad genoomi põhjustades muutunud lokaalset geeniekspressiooni. Kui rakud koguvad veel lisamutatsioone või leiab aset immuunsüsteemi nõrgenemine, siis võivad sellised rakud viia vähi tekkeni. 

- **kaudne mehhanism**, viirusinfektsioon põhjustab põletikku. Krooniline põletik tõstab vähitekke riski selles koes.

---

# src paradigma

Põhinedes RSV võimel mõni päev peale nakatamist rakke transformeerida, töötati 1958. Temini a Rubini poolt välja nn **_focus assay_** 

- Fookuste hulk oli otseses seoses rakkudele lisatud RSV hulgaga, seega oli RSV täiesti piisav peremeesraku transformeerimiseks.

---

## Paljunemine ja raku transformeerimine on viirusel eraldi funktsioonid

- **Raku fenotüüp on viiruse genoomi kontrolli all**, on olemas RSV mutandid, mis põhjustavad transformeerimisel rakkudel pikenenud fenotüübi;

- **viiruse paljunemine pole raku transformatsiooniks vajalik**, replikatsiooni-defektne mutant transformeeris rakke ilma viirust tootmata;

- **tekivad spontaansed mutandid mis replitseeruvad kuid enam ei transformeeri**, enamus RSV liine on mitte-defektsed (neil on genoomis olemas kõik viiruse replikatsiooniks vajalikud geenid ja onkogeen).

---

# Rousi sarkoomi viiruse geenide aktiivsus on vajalik transformatsiooniks

- RSV-indutseeritud transformatsioon kandub järglasrakkudele edasi.

- Kas tegemist on nn. *hit and run* mehhanismiga või on viiruse aktiivsus transformatsiooniks permanentselt vajalik
    - *hit and run*: transformeerunud fenotüüp kandub edasi juba viirusest sõltumatult.

- Viirusgeenide vajalikkus selgus 1970 kui avaldati *Nature* artikkel kus kirjeldati  temperatuuritundliku (*ts*) RSV mutandiga tehtud katseid:
    - transformatsioon oli temperatuuritundlik, kuid viiruse replikatsioon mitte.

---

# ALV/RSV virion

```{r}
knitr::include_graphics("http://o.quizlet.com/i.WMzcRr-oCjtmBh2GiwwA.png")
```


--- 

# Metsik tüüpi RSV vs. transformatsioonidefektne (td)

td RSV genoom on väiksem

```{r}
knitr::include_graphics("http://www.nature.com/nrc/journal/v12/n9/images/nrc3320-f1.jpg")
```


---

# Lihtsa retroviiruse elutsükkel

```{r}
knitr::include_graphics("http://o.quizlet.com/xJ0AWub9I3KjpnUom79whw.png")
```

---

# RSV src pärineb raku genoomist

.pull-left[
Kasutades ära 1970 aastal RSV-st avastatud RNA sõltuvat DNA polümeraasi (pöördtranskriptaas) näidati, et selles viiruses olev transformeeriv src RNA järestus on pärit linnu genoomist.

*The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1975 was awarded jointly to David Baltimore, Renato Dulbecco and Howard Martin Temin "for their discoveries concerning the interaction between tumour viruses and the genetic material of the cell".*
]

.pull-right[

```{r}
knitr::include_graphics("http://o.quizlet.com/Eby4zdSHLvqEuPGeLks7bA.png")
```
]

---

### Retroviiruste onkovalkude funktsionaalsed klassid

```{r}
vir <- readr::read_delim("Klass | Näide | Viirus
kasvufaktor | Sis (PDGFB) | ahvi sarkoomiviirus
retseptor TK | ErbB (EGFR) | linnu erütroblastoosi viirus
hormoonretseptor | ErbA (THRA) | linnu erütroblastoosi viirus
G valk | Ha-ras, GTPase | Harvey sarkoomiviirus
          | Ki-ras, GTPase|  Kirsten sarkoomiviirus
adaptorvalk | Crk, modulaarne signaali link CT10 | linnu sarkoomiviirus
mitte-retseptor TK| Src, tsütoplasma kinaas | Rousi sarkoomiviirus
                            | Abl, tsütoplasma kinaas | Abelsoni hiire leukemia virus
seriin/treoniin kinaas | Akt, tsütoplasma kinaas | Akt8 hiire thymoma virus
                        | Mos, tsütoplasma kinaas | Moloney hiire sarkoomiviirus
transkriptsiooni regulaator |  Jun, AP1 TF kompleks | linnu sarkoomiviirus 17
                          | Fos, AP1 TF kompleks | Finkel–Biskis–Jinkins hiire sarkoomiviirus
                          | Myc, transkriptsioonifaktor | linnu müelotsütomatoosi viirus MC29
lipiidikinaas | Pi3k | linnu sarkoomiviirus 16", delim = "|")
virtab <- knitr::kable(vir, format = "html")
kableExtra::kable_styling(virtab, "striped", position = "left", font_size = 12)
```


---

### Ka mitte transformeerivad viirused võivad aktiveerida proto-onkogeene genoomi insertsioonil

```{r}
vir <- readr::read_delim("Geen | Viirus | Kasvaja | Liik | Onkovalk
myc | ALV | B-raku lümfoom | kana | transkriptsiooni faktor
myc | ALV, FeLV | T-raku lümfoom | kana, kass | transkriptsiooni faktor
nov | ALV | nefroblastoom | kana | kasvufaktor
erbB | ALV | erütroblastoos | kana | retseptor TK
int-1 (Wnt-1) | MMTV |  rinnanäärme kartsinoom |  hiir | kasvufaktor
int-2 (FGF) | MMTV | rinnanäärme kartsinoom | hiir | kasvufaktor
int-3 (notch)| MMTV | rinnanäärme kartsinoom|  hiir | retseptor
pim-1 | Mo-MLV | T-raku lümfoom | hiir | ser/thr kinaas
bmi-1 | Mo-MLV | T-raku lümfoom | hiir|  transkriptsiooni repressor
tpl-2 | Mo-MLV | T-raku lümfoom | hiir | mitte-retseptor TK
lck | Mo-MLV |  T-raku lümfoom | hiir | mitte-retseptor TK
p53 | Mo-MLV | T-raku lümfoom | hiir | transkriptsioonifaktor
IL2 | GaLV | T-raku lümfoom | gibbon ape | tsütokiin
K-ras |F-MLV | T-raku lümfoom | hiir | väike G valk
CycD1 | F-MLV | T-raku lümfoom | hiir | G1 tsükliin", delim = "|")
virtab <- knitr::kable(vir, format = "html")
kableExtra::kable_styling(virtab, "striped", position = "left", font_size = 12)
```


---

# Viiruse onkogeenid: RNA versus DNA viirused

- Retroviiruste onkogeenid on rakulist päritolu ja peamiselt dereguleerivad signalisatsiooni ja transkriptsiooni kontrolli (SRC, MYC, RAS, ERBB).

- Onkogeensed DNA viirustel on aga genoomis isiklikud onkogeenid: HPV E6, SV40 LT (*large T*).

- **DNA viiruste onkogeenid toimivad rakuliste kontrollmehhanismide blokeerimise teel**, nt. HPV E6 ja SV40 LT inhibeerivad p53, HPV E7 inhibeerib RB-d.  

---

# Viiruse onkovalkude päritolu

Kas (i) viirus paneb rakulise jagunemise masinavärgi tööle selleks, et paljuneda või (ii) üritab immunsüsteemile märkamatuks jääda.

.pull-left[

```{r, out.width=260}
knitr::include_graphics("http://www.nature.com/nrc/journal/v10/n12/images/nrc2961-f3.jpg")
```

]

.pull-right[
- Viiruse onkogeenid inhibeerivad raku tuumor-supressor funktsioone (**piiratud ressursid**), et tagada viiruse paljunemine ja vähi teke on tingitud juhuslikest mutatsioonidest.
- Viiruse strateegia on peremehe kaasasündinud (*innate*) immuunsuse vaiki hoidmine: tuumorsuppressorid on hõivatud ka kaasasündinud immuunsuses.
]

---

## Landscape of genomic alterations in cervical carcinomas

.pull-left[

- HPV integration occurred closer to amplified regions than expected by chance. 
- Viral integration was localized to one locus in most tumours investigated. 
- Many of the genes involved in the integration events are members of cellular pathways known to have important roles in cancer.
]

.pull-right[

```{r, out.height=380}
knitr::include_graphics("http://www.nature.com/nature/journal/v506/n7488/images/nature12881-f3.jpg")
```

]

.footer[Pilt: The genomic landscape and evolution of endometrial carcinoma progression and abdominopelvic metastasis. [doi:10.1038/ng.3602](http://www.nature.com/ng/journal/vaop/ncurrent/full/ng.3602.html)
]

???

Relationships between HPV integration, copy-number amplifications and gene expression in cervical carcinoma

---

# Altered immune response in cervical carcinomas

- Mutations in the HLA-B, HLA-A and in the $\beta2$-microglobulin (B2M) genes. 
- All mutations in these three genes were within the antigen-presenting domains of each respective protein.
- Pathway analyses also revealed that the most significantly mutated gene set in squamous cell carcinomas involves immune response genes in the interferon-γ signalling pathway, including mutations in IFNG and JAK2. 
- Together, these data highlight the significance of the synergy between HPV infection and an altered immune response in squamous cell carcinomas of the cervix.

---

# SV40 kasutab samu mehhanisme mis toimivad spontaansetes kasvajates

.pull-left[

- The co-occurrence of PPP2R1A and TP53 mutations mirrors the dual mechanism of transformation by the SV40 oncovirus.
- **Small T antigen binds PPP2R1A** to disrupt association with PP2A regulatory subunits 
- and **large T antigen mediates TP53 inactivation**.
]

.pull-right[

```{r, out.width=240}
knitr::include_graphics("assets/img/Gibson2016SuppFig12.png")
```

]

---

# Comprehensive molecular characterization of gastric adenocarcinoma

.pull-left[

- EBV is found within malignant epithelial cells in 9% of gastric cancers.
- Amplification of 9p locus containing JAK2, CD274 and PDCD1LG2 was enriched in the EBV subgroup (15% of tumours).
    - JAK2 encodes a receptor tyrosine kinase and potential therapeutic target. 
    - CD274 and PDCD1LG2 encode PD-L1 and PD-L2, immunosuppressant proteins.
]

.pull-right[

```{r}
knitr::include_graphics("assets/img/gastriccancer.jpg")
```

]

---
class: inverse, center, middle

# Lingid loengutele

---
class: middle

.pull-left[

- [Sissejuhatav loeng](http://tpall.github.io/onkobioloogia)
- [Onkoviirused](http://tpall.github.io/Onkoviirused)
- [Onkogeenid](http://tpall.github.io/Onkogeenid)
- [Retseptorid](http://tpall.github.io/Retseptorid)
- [Signaalirajad](http://tpall.github.io/Signaalirajad)
- [Tuumorsupressorgeenid](http://tpall.github.io/Tuumorsupressorid)
- [Rakutsüklikontroll](http://tpall.github.io/Rakutsyklikontroll)

]

.pull-right[

- [p53 ja apoptoos](http://tpall.github.io/p53-ja-apoptoos)
- [Immortalisatsioon](http://tpall.github.io/Immortalisatsioon)
- [Tumorigenees](http://tpall.github.io/Tumorigenees)
- [Genoomiterviklikkus](http://tpall.github.io/Genoomiterviklikkus)
- [Mikrokeskkond](http://tpall.github.io/Mikrokeskkond)
- [Metastaasid](http://tpall.github.io/Metastaas)
- [Immuunsus](http://tpall.github.io/Immuunsus)
- [Vahiravim](http://tpall.github.io/Vahiravim) 
]