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Introducción a los métodos de recuento
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Técnicas de recuento no automáticas
2.1. Recuento en placa
2.2. Recuento por filtración
2.3. Método del número más probable (NMP)
2.4. Recuento directo mediante un microscopio
2.5. Método de turbidez
2.6. Determinación del peso seco
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Técnicas de recuento automáticas
3.1. Recuento por resistencia eléctrica
3.2. Recuento por citometría de flujo
3.3. Recuento por análisis de imagen
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Bibliografía
En biología, la necesidad de un método de estimación de densidad de microorganismos in situ, es más patente día a día. Y es que se trata de una herramienta muy útil a la hora de realizar estimas en estudios de microbiología y genética. El recuento de microorganismos indica la magnitud de la población total bacteriana y puede determinarse mediante el conteo celular (de forma directa mediante el microscopio o un contador electrónico de partículas o de forma indirecta mediante el conteo de colonias), la determinación de la masa celular (de forma directa pesando el contenido celular del nitrógeno o de forma indirecta mediante turbidimetría) y la actividad celular (únicamente de forma indirecta, mediante la relación de la actividad metabólica y el tamaño de una población bacteriana).
Se trata de la técnica más común y usada para contar bacterias. Se preparan una serie de diluciones decimales que son sembradas en distintas placas de petri (mínimo 3 por dilución). Durante el crecimiento, cada célula o pequeño grupo de células dará a lugar a una colonia que estará separada del resto. A cada una estas células o grupos que originarán las colonias se las conoce como unidades formadoras de colonias (UFC). De entre las distintas diluciones, se elegirán aquellas que presenten un número de colonias que oscile entre 25 y 250. Los cálculos se realizarán de la siguiente manera:
La principal ventaja de este método es que determina solamente el total de células vivas que se han sembrado en la placa, ya que de otro modo, estas no habrían logrado reproducirse y formar una colonia. Por otro lado, sus principales desventaja son que es necesario un mínimo de 24 horas para que tenga lugar el crecimiento de las colonias y que una misma UFC puede contener varias bacterias que hayan quedado adheridas y hayan producido la colonia.
Es método se realiza cuando la cantidad de bacterias es muy pequeña. Consiste en una solución de al menos 100 mL que atraviesa una membrana delgada con poros lo suficientemente pequeños para que no logren pasar las bacterias, siendo entonces la superficie del filtro, para ser transferido a una placa de petri donde crecerán las futuras colonias. Si además se le aplica un medio selectivo o diferencial, las colonias obtenidas serán lo suficientemente distintas unas de otras como para identificar la bacteria que las produce. Se usa en análisis de contaminación fecal en aguas.
Se trata de método estadístico, basado en el hecho de que a mayor número de bacterias en una muestra, mayor será la dilución necesitada para reducir la densidad hasta el punto en que ninguna bacteria pueda crecer en los tubos en los que se encuentra la dilución. Las muestras se añaden a distintos tubos de ensayo con soluciones de lactosa y en ocasiones, un gas derivado de la fermentación por parte de estos organismos. Este método resulta particularmente útil cuando las bacterias del estudio no crecen en medio sólido o cuando su crecimiento en un medio líquido es diferencial.
Esta técnica se usa para el recuento de células totales, es decir, tanto vivas como muertas. Consiste en la preparación de un volumen conocido de la suspensión de células sobre un área conocida del portaobjetos. Después de haber fijado y teñido la muestra, es posible realizar un recuento de las bacterias con el microscopio.
Debido a la dificultad que genera contar todas y cada una de las bacterias presentes en la muestra, se cuentan las células presentes en unos cuantos campos microscópicos al azar. Para facilitar esta técnica pueden usarse cámaras de Hawksley o de Petroff-Hausser. La primera tiene la ventaja que puede ser utilizada con objetivos de inmersión, aunque la mayoría de los recuentos se realizan con objetivos secos.
(“Cámara de recuento microbiano de Petroff-Hausser”. Vanessa Gaona, 2016)
Con este método podemos saber fácilmente el número de microorganismos por mililitro sabiendo que:
Una de las principales ventajas del recuento directo mediante un microscopio, es la información adicional que nos brinda sobre el tamaño y la morfología de las bacterias.
En algunas ocasiones, la turbidez sirve para estimar el número de bacterias y su crecimiento en un medio líquido. Para esta técnica se usa un espectrofotómetro que con un haz de luz que atraviesa una solución de estas bacterias es capaz de calcular la absorbancia de la misma frente a una solución control. Tiene una serie de desventajas, como un elevado número de células necesarias para que el espectrofotómetro pueda detectar un cambio en la absorbancia de la dilución y que por lo tanto, este método no es útil para soluciones en las cuales haya una cantidad relativamente pequeña de células.
Se trata del método más directo de medición cuantitativa de la masa celular. Se trata de extraer las bacterias de su medio de cultivo mediante filtración y posteriormente drenarlas mediante un secador para luego pesar el material resultante.
Mediante un dispositivo conocido como contador de Coulter, es posible contar células y medir su volumen. Se basa en el hecho de que las células muestran una gran resistencia eléctrica, es decir, son poco conductoras. En este aparato, las células están en una solución que conduce la electricidad y que se hace pasar por un conducto estrecho con dos electrodos que también son conductores. Cuando no hay células en el conducto, la electricidad fluye sin interrupciones, pero cuando una célula pasa a través de él, la corriente se interrumpe. Este aparato además mide la corriente, que se relaciona directamente con el tamaño de la célula que cruza el conducto. Su mayor ventaja es que un método bastante simple que permite contar miles de células por segundo con una gran precisión y significación estadística.
La citometría de flujo es posiblemente uno de los métodos más sofisticados y costosos a la hora de realizar un recuento celular. En un citómetro de flujo, las células fluyen en una corriente que se estrecha mientras que un rayo láser las detecta una a una y un receptor capta la luz reflejada desde ellas.
Con este aparato se puede analizar la forma de las células y sus estructuras internas y externas, así como medir la cantidad de proteínas específicas y otros compuestos bioquímicos.
Mediante imágenes microscópicas de alta calidad sobre las cuales y un algoritmo de clasificación se es capaz de detectar y contar de forma automática mediante un ordenador.
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Pelczar, M.J. (1982). Microbiology (2nd edition). Mc Graw Hill.
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Pommerville, J.C. (2010). Alcamo’s fundamentals of Microbiology (4th edition). Jones and Bartlett Publishers.