通常我们得到一个感兴趣的基因之后会进行全长基因的扩增，首先就要设计扩增引物来获取目的基因片段。
引物（英文：primer）是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，存在于自然中生物的DNA复制（RNA引物）和聚合酶链式反应（PCR）中人工合成的引物（通常为DNA引物）。
1、引物长度一般在15-30bp
2、引物GC含量一般为40%-60%
4、引物3’端的碱基一般不用A
5、引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。
6、引物3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。
7、引物5’端可以修饰
8、碱基要随机分布，且引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补。
9、至少跨越一个外显子设计引物
在抽提RNA的过程中，样本中的基因组DNA污染会显著影响最终的结果，虽然可以使用DNase I进行处理将RNA样本中的中DNA降解掉，但是很难保证DNA降解完全。当然这需要你知道基因的具体结构。
还有很多。。。
A real-time polymerase chain reaction (real-time PCR), also known as quantitative polymerase chain reaction (qPCR), is a laboratory technique of molecular biology based on the polymerase chain reaction(PCR). It monitors the amplification of a targeted DNA molecule during the PCR (i.e., in real time), not at its end, as in conventional PCR. Real-time PCR can be used quantitatively (quantitative real-time PCR) and semi-quantitatively (i.e., above/below a certain amount of DNA molecules) (semi-quantitative real-time PCR).
在实时荧光定量 PCR 中，每次循环结束后通过荧光染料检测 DNA 的量，荧光染料产生的荧光信号与生成的 PCR产物分子 (扩增片段) 数直接成正比。
实时荧光定量 PCR 仪通过绘制荧光与循环数曲线，生成扩增曲线，表示在整个 PCR 反应过程中积聚的产物。
实时荧光定量 PCR 的优点包括：
• 能够实时监控 PCR 反应的进程
• 能够精确测定每个循环的扩增片段数量，从而对样本中的起始材料量进行准确定量
• 具有更大的检测动态范围
• 在单管中实现扩增和检测，无需 PCR 后处理
==基线==
实时荧光定量 PCR 反应的基线是指在 PCR 的最初几个循环中 (一般为第 3 至 15 个循环) 的信号水平，此阶段的荧光信号变化极小。低水平的基线信号相当于反应的背景或“噪声” 。
==阈值==
实时荧光定量 PCR 反应的阈值信号水平较计算出的基线信号水平有显著增加 。设置阈值可将相关扩增信号从背景中区分出来。
==Ct (阈值循环)==
阈值循环 (Ct) 是反应的荧光信号与阈值交叉的循环数。Ct值可用于计算起始 DNA 拷贝数，因为 Ct 值与起始靶点量呈反比。
==标准曲线==
利用连续稀释的已知样本建立标准曲线，确定实验样本的目的模板起始量，或者评估反应效率。以已知的连续稀释浓度的对数为横坐标 (x 轴)，该浓度对应的 Ct 值为纵坐标 (y 轴)，绘制曲线。
- 相关系数(R2)
相关系数可用于表示数据与标准曲线之间的契合度。R2 值反映了标准曲线的线性度。在理论上，R2 = 1，但 0.999 一般为最大值。
- Y-截距
y-截距表示反应的理论最低检测限，或者 x 轴上的最低拷贝数的靶分子产生明显扩增时的预期 Ct 值。尽管 PCR 在理论上能够检测单拷贝靶点，但在实时荧光定量 PCR 应用中能可靠定量的最低靶点量通常为 2–10 拷贝。
- 指数期
在指数期的早期，而不是指数期的晚期或反应达到平台时进行实时荧光定量 PCR 反应定量十分重要。在指数期的开始，所有试剂仍有剩余，DNA 聚合酶仍然高效，扩增产物的量较少，不会竞争引物的退火性能。
- 斜率
扩增反应的对数线性期的斜率可用于检测反应效率。要获得准确且可重复的结果，反应效率应尽可能接近 100%，相当于斜率为 -3.32。
- 效率
100% 的 PCR 效率对应的斜率为 -3.32，可根据下列等式确定：
效率 = 10(-1/斜率) -1
理论上，PCR 反应的效率 (E) 应为 100%，表示在指数扩增阶段每次热循环后的模板倍增。良好的反应效率应在 90% 至 110% 之间，其对应的斜率为 -3.58 至-3.10。
==绝对定量==
绝对定量是指在实时荧光定量 PCR 实验中，对已知量的样本进行连续稀释后扩增，生成标准曲线。然后通过与此曲线比较，定量未知样本。
==相对定量==
相对定量是指在实时荧光定量 PCR 实验中，将一个样本 (已处理) 中的目的基因表达与另一个样本 (未处理) 中相同基因的表达相比较。结果以处理样本的表达量相对于未处理样本表达量的倍数变化 (增加或减少) 表示。此类型的定量采用标准品基因 (如 β-actin) 作为实验差异对照品。
==熔解曲线==
随着反应温度的升高，当结合染料分子的双链 DNA (dsDNA) 解离或“熔解”成单链 DNA (ssDNA)时，观察到的荧光强度的变化。例如，当加热结合有SYBR. Green I 染料的双链 DNA 时，其达到熔点 (Tm) 后，由于 DNA 链的解离和染料的释放，检测的荧光强度会出现突然下降。绘制荧光强度与温度图，及 -ΔF/ΔT(荧光变化/温度变化) 与温度图，清晰显示熔解曲线动态范围。
Ct值定量的数学原理：
理想的PCR反应：
n：扩增循环次数；X0：起始模板数量；Xn：第n次循环后扩增产物数量
非理想的PCR反应：
n：扩增循环次数；X0：起始模板数量；Xn：第n次循环后扩增产物数量；En：扩增效率
在扩增产物达到荧光阈值时：
XCt：荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量，在阈值设定后它是一个常数，定为M
两边同取对数得：
整理方程式：
因此起始模板量的Log值与Ct值成线性关系，模板DNA量越多，荧光达到阈值的循环数越少，即Ct值越小。
要进行绝对定量，需对已知浓度的目标模板溶液进行几次连续稀释，采用实时荧光定量 PCR 扩增，利用获得的数据生成标准曲线，标准曲线以各靶点浓度及相应的 Ct 值绘制。然后将未知样本的 Ct 值与此标准曲线进行比较，确定其拷贝数。
$$ 2^-ΔΔCt 法 $$
两个基因(目的基因和内参基因) 必须有相一致的扩增效率，并尽可能接近100% !
同时扩增目的基因和内参基因， 通过查看扩增曲线中指数增长期是否平行来确定扩增效率是否相似。
- 步骤1: 内参基因均一化样本差异
Ct 目的基因– Ct 内参基因= ΔCt
- 步骤2: 其他样本和对照样本比较
ΔCt 处理样本– ΔCt 对照样本= ΔΔCt
- 步骤3: 使用公式计算
倍数变化 = 2-ΔΔCt
相对标准曲线法
任何数量充足，并表达目的基因和内参基因的浓度较高cDNA；只需知道稀释倍数, 不需要知道浓度
