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Practica_Dia3/scripts/DEG_analysis.R

@@ -0,0 +1,159 @@
+######
+# Script : Analisis de expresion diferencial
+# Author: Sofia Salazar, Diego Ramirez y Evelia Coss
+# Date: 27/02/2024
+# Description: El siguiente script nos permite realiza el Analisis de expresion Diferencial
+# a partir de los datos provenientes del alineamiento de STAR a R,
+# Primero correr el script "load_data_inR.R"
+# Usage: Correr las lineas en un nodo de prueba en el cluster.
+# Arguments:
+#   - Input: metadata.csv, cuentas de STAR (Terminacion ReadsPerGene.out.tab)
+#   - Output: Matriz de cuentas (CSV y RData)
+#######
+
+# qlogin 
+# module load r/4.0.2
+# R
+
+# --- Load packages ----------
+library(DESeq2)
+
+# --- Load data -----
+# Cargar archivos
+indir <- "/mnt/Guanina/bioinfo24/data/Clase_RNASeq2024/STAR_output"
+outdir <- "/mnt/Guanina/bioinfo24/data/Clase_RNASeq2024/results/"
+figdir <- '/mnt/Guanina/bioinfo24/data/Clase_RNASeq2024/results/figures/'
+
+#Cargar variable "counts", proveniente del script "load_data_inR.R"
+load("/mnt/Guanina/bioinfo24/data/Clase_RNASeq2024/results/counts/STAR_counts.RData") 
+samples <- metadata$sample_id # Extraer los nombres de los Transcriptomas
+metadata$type <- as.factor(metadata$type) # convertir a factor
+
+# --- DEG ----
+counts <- counts[5:129239, ] # Filtramos los rows con informacion general sobre el mapeo
+counts <- counts[which(rowSums(counts) > 10),] #Seleccionamos genes con mas de 10 cuentas
+
+# Convertir al formato dds
+dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData =  counts, 
+            colData = metadata, design = ~type) #Se hace un DESeqDataSet para realizar un analisis
+
+dim(dds) # checar las dimensiones
+#[1] 33470     8
+
+##  -- Asignar la referencia y generar contrastes -----
+# Las comparaciones se realizan por pares
+#Si no se indica de manera explicita que se va a comparara, lo va a tomar de manera alfabetica, 
+# en este caso se indica que control es la referencia, 
+dds$type <- relevel(dds$type, ref = "CONTROL") 
+
+## --- Obtener archivo dds ----
+
+dds <- DESeq(dds)
+
+# estimating size factors
+# estimating dispersions
+# gene-wise dispersion estimates
+# mean-dispersion relationship
+# final dispersion estimates
+# fitting model and testing
+
+# Obtener la lista de coeficientes
+resultsNames(dds)
+
+# [1] "Intercept"                 "type_PLS_15min_vs_CONTROL"
+# [3] "type_PLS_30min_vs_CONTROL" "type_PLS_4h_vs_CONTROL"
+
+# Guardar la salida del diseno
+save(metadata, dds, file = paste0(outdir, 'dds_Times_vs_control.RData'))
+
+## --- Normalizacion de los datos ---------
+# Opcion 1. log2(n + 1)
+ntd <- normTransform(dds)
+
+# Opcion 2. regularized logarithm or rlog
+# Normalizacion de las cuentas por logaritmo y podrias hacer el analisis usando este objeto en lugar del dds
+ddslog <- rlog(dds, blind = F) 
+
+# Almacenar la grafica
+png(file = paste0(figdir, "PCA_rlog.png"))
+plt <- plotPCA(ddslog, intgroup = "type")
+print(plt)
+dev.off()
+
+# Opcion 3. vsd
+# Estima la tendencia de dispersion de los datos y calcula la varianza, hace una normalizacion de las 
+# cuentas con respecto al tamaño de la libreria
+vsdata <- vst(dds, blind = F) 
+
+# Almacenar la grafica
+png(file = paste0(figdir, "PCA_vsd.png"))
+plt <- plotPCA(vsdata, intgroup = "type")
+print(plt)
+dev.off()
+
+# Guardar la salida del diseno (vsdata)
+save(metadata, vsdata, file = paste0(outdir, 'vst_Times_vs_control.RData'))
+
+# En la grafica de las primeras dos componentes principales son notorias las diferencias 
+# entre tipos de muestras con respecto a las componente principales que capturan su varianza, 
+# cada componente principal representa una combinacion lineal de las variables (en este caso genes) 
+# que explican la mayor cantidad de varianza en nuestros datos (las cuentas).
+
+
+## ---- Obtener informacion del contraste 1 ----
+# results(dds, contrast=c("condition","treated","untreated"))
+res_15t <- results(dds, name = "type_PLS_15min_vs_CONTROL")
+res_15t
+
+summary(res_15t)
+
+# out of 33470 with nonzero total read count
+# adjusted p-value < 0.1
+# LFC > 0 (up)       : 1657, 5%
+# LFC < 0 (down)     : 811, 2.4%
+# outliers [1]       : 0, 0%
+# low counts [2]     : 18169, 54%
+# (mean count < 12)
+# [1] see 'cooksCutoff' argument of ?results
+# [2] see 'independentFiltering' argument of ?results
+
+# Guardar los resultados
+write.csv(res_15t, file=paste0(outdir, 'DE_15min_vs_control.csv'))
+
+## ---- Obtener informacion del contraste 2 ----
+res_30t <- results(dds, name = "type_PLS_30min_vs_CONTROL")
+res_30t
+
+summary(res_30t)
+
+# out of 33470 with nonzero total read count
+# adjusted p-value < 0.1
+# LFC > 0 (up)       : 1309, 3.9%
+# LFC < 0 (down)     : 1300, 3.9%
+# outliers [1]       : 0, 0%
+# low counts [2]     : 19467, 58%
+# (mean count < 15)
+# [1] see 'cooksCutoff' argument of ?results
+# [2] see 'independentFiltering' argument of ?results
+
+# Guardar los resultados
+write.csv(res_30t, file=paste0(outdir, 'DE_30min_vs_control.csv'))
+
+## ---- Obtener informacion del contraste 3 ----
+res_4t <- results(dds, name = "type_PLS_4h_vs_CONTROL")
+res_4t
+
+summary(res_4t)
+
+# out of 33470 with nonzero total read count
+# adjusted p-value < 0.1
+# LFC > 0 (up)       : 4289, 13%
+# LFC < 0 (down)     : 3409, 10%
+# outliers [1]       : 0, 0%
+# low counts [2]     : 6489, 19%
+# (mean count < 3)
+# [1] see 'cooksCutoff' argument of ?results
+# [2] see 'independentFiltering' argument of ?results
+
+# Guardar los resultados
+write.csv(res_4t, file=paste0(outdir, 'DE_4h_vs_control.csv'))

Practica_Dia3/scripts/VisualizacionDatos.R

@@ -0,0 +1,93 @@
+######
+# Script : Visualizacion grafica de los resultados de DEG
+# Author: Sofia Salazar, Diego Ramirez y Evelia Coss
+# Date: 27/02/2024
+# Description: El siguiente script nos permite realiza el Analisis de expresion Diferencial
+# a partir de los datos provenientes del alineamiento de STAR a R,
+# Primero correr el script "load_data_inR.R"
+# Usage: Correr las lineas en un nodo de prueba en el cluster.
+# Arguments:
+#   - Input: metadata.csv, cuentas de STAR (Terminacion ReadsPerGene.out.tab)
+#   - Output: Matriz de cuentas (CSV y RData)
+#######
+
+# qlogin 
+# module load r/4.0.2
+# R
+
+# --- Load packages ----------
+library(dplyr)
+library(pheatmap)
+library(ggplot2)
+
+# --- Load data -----
+# Cargar archivos
+indir <- "/mnt/Guanina/bioinfo24/data/Clase_RNASeq2024/STAR_output"
+outdir <- "/mnt/Guanina/bioinfo24/data/Clase_RNASeq2024/results/"
+figdir <- '/mnt/Guanina/bioinfo24/data/Clase_RNASeq2024/results/figures/'
+
+#Cargar variable "dds", proveniente del script "DEG_analysis.R"
+load("/mnt/Guanina/bioinfo24/data/Clase_RNASeq2024/results/dds_Times_vs_control.RData") 
+
+#Cargar variable "vsdata", proveniente del script "DEG_analysis.R"
+load("/mnt/Guanina/bioinfo24/data/Clase_RNASeq2024/results/vst_Times_vs_control.RData") 
+
+#Cargar variable "res_30t", proveniente del script "DEG_analysis.R"
+load("/mnt/Guanina/bioinfo24/data/Clase_RNASeq2024/results/DE_30min_vs_control.csv") 
+
+# ---- volcano plot ----
+df <- as.data.frame(res_30t)
+# padj 0.05 y log2FoldChange de 2
+df <- df %>% 
+  mutate(Expression = case_when(log2FoldChange >= 2 & padj < 0.05 ~ "Up-regulated",
+                                log2FoldChange <= -(2) & padj < 0.05 ~ "Down-regulated",
+                                TRUE ~ "Unchanged"))
+
+# visualizacion
+png(file = paste0(figdir, "VolcanoPlot_30min_vs_control.png"))
+
+ggplot(df, aes(log2FoldChange, -log(padj,10))) +
+  geom_point(aes(color = Expression), size = 0.7) +
+  labs(title = "30min vs control") +
+  xlab(expression("log"[2]*"FC")) + 
+  ylab(expression("-log"[10]*"p-adj")) +
+  scale_color_manual(values = c("dodgerblue3", "gray50", "firebrick3")) +
+  guides(colour = guide_legend(override.aes = list(size=1.5))) +
+  geom_vline(xintercept = 2, linetype = "dashed", color = "black", alpha = 0.5) +
+  geom_vline(xintercept = -(2), linetype = "dashed", color = "black", alpha = 0.5) +
+  geom_hline(yintercept = -log10(0.05), linetype = "dashed", color = "black", alpha = 0.5)
+
+dev.off()
+
+# --- Heatmap (vsd) -----
+topGenes <- head(order(res_30t$padj), 20) # Obtener el nombre de los 20 genes con p value mas significativo
+
+png(file = paste0(figdir, "Heatmap_vsd_topgenes.png"))
+pheatmap(assay(vsdata)[topGenes,], cluster_rows=FALSE, show_rownames=TRUE,
+         cluster_cols=FALSE)
+dev.off()
+
+# --- Heatmap  (por contrastes) (log2 Fold Change) -----
+betas <- coef(dds)
+colnames(betas)
+
+# [1] "Intercept"                 "type_PLS_15min_vs_CONTROL"
+# [3] "type_PLS_30min_vs_CONTROL" "type_PLS_4h_vs_CONTROL"
+
+mat <- betas[topGenes, -c(1,2)] # crear la matriz con el topgene de genes
+
+# Filtro de 3 log2foldchange
+thr <- 3 
+mat[mat < -thr] <- -thr
+mat[mat > thr] <- thr
+
+# Almacenar la grafica
+png(file = paste0(figdir, "Heatmap_log2FoldChage_topgenes.png"))
+pheatmap(mat, breaks=seq(from=-thr, to=thr, length=101),
+         cluster_col=FALSE)
+dev.off()
+
+# https://master.bioconductor.org/packages/release/workflows/vignettes/rnaseqGene/inst/doc/rnaseqGene.html#time-course-experiments
+
+
+

Practica_Dia3/scripts/load_data_inR.R

@@ -0,0 +1,43 @@
+######
+# Script : Importar datos de cuentas en R
+# Author: Sofia Salazar, Diego Ramirez y Evelia Coss
+# Date: 27/02/2024
+# Description: El siguiente script nos permite importar los datos provenientes del alineamiento de STAR a R,
+# para el posterior analisis de Expresion diferencial con DESEq2.
+# Usage: Correr las lineas en un nodo de prueba en el cluster.
+# Arguments:
+#   - Input: metadata.csv, cuentas de STAR (Terminacion ReadsPerGene.out.tab)
+#   - Output: Matriz de cuentas (CSV y RData)
+#######
+
+# qlogin 
+# module load r/4.0.2
+# R
+
+# --- Load data -----
+# Cargar archivos
+indir <- "/mnt/Guanina/bioinfo24/data/Clase_RNASeq2024/STAR_output"
+outdir <- "/mnt/Guanina/bioinfo24/data/Clase_RNASeq2024/results/"
+setwd(indir)
+files <- dir(pattern = "ReadsPerGene.out.tab")
+counts <- c() # esta sera la matriz
+for(i in seq_along(files)){
+  x <- read.table(file = files[i], sep = "\t", header = F, as.is = T)
+  # as.is para no convertir tipo de datos
+  counts <- cbind(counts, x[,2])
+}
+
+# Cargar Metadatos
+metadata <- read.csv("/mnt/Guanina/bioinfo24/data/Clase_RNASeq2024/metadata.csv", header = F)
+# Renombrar columnas con el ID de los transcriptomas
+colnames(metadata) <- c("sample_id", "type")
+# Convertir a formato dataframe
+counts <- as.data.frame(counts)
+rownames(counts) <- x[,1] # Renombrar las filas con el nombre de los genes
+colnames(counts) <- sub("_ReadsPerGene.out.tab", "", files)
+
+# almacenar metadata y matriz de cuentas
+save(metadata, counts, file = paste0(outdir, 'counts/STAR_counts.RData'))
+
+# Guardar informacion de ejecucion
+sessionInfo()