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Human Genome Reference

參考序列的起源

1990年代，人類基因組計劃(Human Genome Project)開始致力於定序全基因體，想定出的範圍包含：

The complete human genome consists of 22 diploid chromosomes (1 − 22), two sex chromosomes (X and Y) and maternally inherited mitochondrial DNA (mtDNA).

初期定序方法是利用Sanger sequencing加genomic shotgun的方式，將序列打成短片段定序後、再組裝（assembly）成長片段序列，整個過程耗時且費力；計畫直到2003年才宣布完成第一條全基因體序列資料，這份資訊也成為人類參考序列的骨幹、並廣泛應用至研究中；不過隨定序技術的進步，如第二代及第三代定序技術的問世，參考序列的解析度逐漸增加，序列資訊不停地經歷修正與重新定序，進而生成不同版的參考序列，本篇文章將針對現今研究最常使用的兩種版本：GRCh37/hg19以及GRCh38/hg38進行討論，包含兩版本的組成結構、版本之間以及版本內部的差異、還有目前的使用心得。

GRCh37/hg19版本發展與差異

GRCh37

  • 發行時間：2009年
  • 檔案名稱：GRCh37.p13.genome.fasta
  • 版本說明：GRCh37 全名 Genome Reference Consortium Human Build 37，是由人類參考序列聯盟(GRC)整理定序的參考序列，定序資料一部分承襲Human Genome Project完成的，另一部分利用WGS shotgun定出unfilled gap 和 error sequence。 最終版本的組成(primary assembly)包含chr1-22,X,Y,MT(mitochondria DNA)以及下面幾種序列分類：

unlocalized sequences：知道来自哪條染色體但不知道具體位置的序列，常以_random命名表示

unplaced sequences：知道来自人類基因组序列，但不知道與染色體的關係，常以chrU_命名表示.

alternate loci：来自基因组特定區域，代表該區域序列的多樣性，常以_alt命名表示.

hg19

  • 發行時間：2009年

  • 檔案名稱：ucsc.hg19.fasta

  • 版本說明：是由UCSC Genome Browser基於GRCh37建立發行的版本，蠻多研究會將兩版本通用，不過和GRCH37也有些差異：

    • 部分contig名稱更動
    • 染色體編號：GRCh37為 1, 2, 3, 4, ….X, Y, MT，hg19為 chr1, chr2, chr3, chr4, …..chrX, chrY, chrM
    • 粒線體版本不同：是兩版本最大的差異，GRCh37納入的是修正版 NC_012920，而hg19是使用舊版 NC_001807

  • 補充: UCSC官網可下載序列資料

b37

  • 檔案名稱：Homo_sapiens_assembly19.fasta
  • 版本說明：是由Broad Institute基於GRCh37建立發行的版本，序列資料包含 GRCh37 使用GATK tool常會以此版作為參考序列。

humanG1Kv37（hs37d5）

  • 檔案名稱：
    • 不包含decoy: human_g1k_v37.fasta
    • 包含decoy: hs37d5.fa, human_g1k_v37_decoy.fasta
  • 版本說明：是由 1000 genomes Project 所完成的版本，相當於b37版本，不同之處在於此版有包含或不包含 decoy sequence (human herpesvirus 4 type 1)兩種。

使用心得

目前研究多使用hs37d5作為參考序列，因在後續分析有最高的準確度，這說明了加上decoy sequence後能增加序列比對的數量。

GRCh38/hg38版本發展與差異

  • 發行時間：2013年

  • 版本說明：和GRCh37版本相比，因定序處理的技術提升，能定序及修正更多區域，如 exon region, SNV and InDels等；GRCh38也試著做annotation of the centromere regions。而UCSC Genome Browser為了避免過往版本號碼不一致 (GRCh37 vs. hg19)造成混淆，也將其版本號碼跳動至hg38，和GRCh38可相通（但GRCh38/hg38間仍需座標轉換）。

  • 補充： GRCh38還有版本更新，NCBI紀錄

與GRCh37/hg19版的差異

  • 最大的差異在於alternative haplotype資訊，為了使參考序列具有全人類的代表性，擴增族群資料可增進序列的多元性，也提升序列比對率，這些資訊主要記錄在ALT contigs中。
  • GRCh38版多了HLA typing的序列，免疫基因對於疾病研究相當重要，HLA資訊提升了參考序列的完整度。
  • 除了序列擴增，GRCh38也嘗試修正參考序列；過去定序技術的限制而導致定序錯誤或無法定序的情況，主要透過新的定序計畫如 1000 Genomes Project協助修正外，也修正了GRCh37/hg19版內含有的false SNPs and indels。

GRCh38/hg38版本間的差異

version GATK Illumina bwakit 1000 Genome NCBI
decoy + + + + +
ALT + + + + +
HLA + + + + -
Contig_Number 3366 3366 5751 3366 2841
file name Homo_sapiens_assembly38.fasta GRCh38_full_analysis_set_plus_decoy_hla.fa hs38DH.fa GRCh38_full_analysis_set_plus_decoy_hla.fa GCA_000001405.15_GRCh38_full_plus_hs38d1_analysis_set.fna

版本差異及使用心得

在GRCh38版本中，依照 bwa-kit 官方建議所產生的 hs38DH.fa 和來自 GATK 的Homo_sapiens_assembly38.fasta contig number （3366）相同，但檔案格式不同，在 HLA typing 的測試中，Kourami 和 Hisat2 兩個軟體在來自 bwa-kit 的 hs38DH.fa 皆有較好的 performance，而來自 bwa-kit 的 hs38DH.fa 可以自行更新，因此所產生的 contig number 會隨之而改變。

Reference

https://gatk.broadinstitute.org/hc/en-us/articles/360035890711-GRCh37-hg19-b37-humanG1Kv37-Human-Reference-Discrepancies.

https://gatk.broadinstitute.org/hc/en-us/articles/360035890951-Human-genome-reference-builds-GRCh38-or-hg38-b37-hg19

https://gatk.broadinstitute.org/hc/en-us/articles/360035891071-Reference-genome

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/grc

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/grc/help/definitions/

https://cloud.google.com/life-sciences/docs/resources/public-datasets/reference-genome

Yan Guo, Yulin Dai, Hui Yu, Shilin Zhao, David C. Samuels, Yu Shyr,Improvements and impacts of GRCh38 human reference on high throughput sequencing data analysis, Genomics,Volume 109, Issue 2,2017,83-90,ISSN 0888-7543, https://doi.org/10.1016/j.ygeno.2017.01.005.