ihsc_transcriptomics

Análisis Multiómico de la Diferenciación de Células Madre Hematopoyéticas Derivadas de iPSC

Descripción general del proyecto

La finalidad de este proyecto es estudiar la diferenciación de células madre hematopoyéticas de larga duración (iHSCs) derivadas de células iPSC humanas, integrando datos de scRNA-seq y RNA-seq bulk.

El análisis se basa en dos fuentes principales:

1. El trabajo de Ng et al., Nature Biotechnology 2025, donde se describen iHSCs con capacidad de injerto a largo plazo generadas a partir de iPSC humanas mediante un programa de mesodermo arterial y endotelio hemogénico.
2. El conjunto de datos GSE232710 (Jacky Y. Li et al.), que recoge RNA mensajero en sobrenadantes de cultivos durante la fase de diferenciación, con y sin tratamiento con retinoide (RETA).

El objetivo es reproducir y extender los análisis de estos estudios, explorando cómo cambian los programas de expresión génica y las firmas de retinoides a lo largo de los distintos estados celulares del linaje iHSC.

Contexto y motivo del estudio

La generación de células madre hematopoyéticas funcionales a partir de iPSC representa un paso clave hacia terapias de reemplazo hematopoyético personalizadas y modelos de enfermedad más precisos. Sin embargo, comprender en detalle los estados celulares intermedios (mesodermo arterial, endotelio hemogénico, pre-HSC, iHSC) y su regulación por señales como el ácido retinoico sigue siendo un reto.

Este análisis multi-ómico permite:

1. Caracterizar los estados celulares descritos por Ng et al. (endotelio arterial, HE, HSPC, progenitores) mediante scRNA-seq.
2. Cuantificar el impacto del tratamiento con retinoides y del tiempo de exposición usando RNA-seq bulk (GSE232710).
3. Integrar ambas capas de datos, proyectando firmas de expresión diferencial del bulk sobre las poblaciones celulares individuales, para identificar qué estados responden más fuertemente a los retinoides y a los programas HOXA/HSC.

Fuentes de datos

Los datos que se utilizan en este proyecto provienen de repositorios públicos:

1. Ng et al. 2025 – iHSC scRNA-seq
   Datos de scRNA-seq 10X Genomics asociados al artículo:
   Ng ES, Sarila G, Li JY, Edirisnghe IS, et al. Long-term engrafting multilineage hematopoietic cells differentiated from human induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 2025.
   (Accesión GEO/SRA cuando esté disponible).

2. GSE232710 – Bulk RNA-seq de sobrenadantes de cultivo
   GEO: GSE232710.
   Datos de RNA-seq obtenidos de sobrenadantes celulares PB BFP 3B5A con diferentes tiempos y condiciones de tratamiento con ácido retinoico (RETA vs control).
   Incluye archivo suplementario GSE232710_RAW.tar (MTX/TSV) y Series Matrix procesada.

Metodología

1. scRNA-seq (Ng et al.)

Para los datos de Ng et al., el flujo general es:

1. Descarga y organización de matrices 10X en data_raw/scRNAseq_Ng2025/.
2. Conversión a AnnData / Seurat usando los scripts de scripts/python/build_scRNAseq_h5ad.py o scripts/R/Seurat_iHSC_template.R.
3. Control de calidad (QC): número de genes, UMIs, porcentaje mitocondrial.
4. Normalización, PCA, vecinos, UMAP y clustering usando Scanpy o Seurat.
5. Anotación de clusters (stroma, endothelium, hemogenic endothelium, HSPC, progenitores) mediante marcadores conocidos.
6. Cálculo de firmas HSC (por ejemplo, RUNX1, MECOM, MLLT3, HLF, HOXA9, SPINK2) y visualización en UMAP.

2. Bulk RNA-seq (GSE232710)

1. Descarga de GSE232710_RAW.tar y de la Series Matrix desde GEO.
2. Descompresión y organización de archivos en data_raw/GSE232710_bulk/ usando scripts/python/unpack_GSE232710.py.
3. Construcción de una matriz de expresión y metadatos de muestra (condición, día, RETA vs NIL).
4. Análisis de expresión diferencial con DESeq2 (scripts/R/DESeq2_GSE232710_template.R), generando tablas de resultados y listas de genes up/down.
5. Visualización mediante volcano plots y heatmaps.

3. Integración scRNA-seq + bulk

1. A partir de los resultados de DESeq2, se definen conjuntos de genes firma (por ejemplo RETA_up, RETA_down).
2. Estas firmas se usan en los notebooks para calcular module scores en el objeto de scRNA-seq (Scanpy/Seurat).
3. Se visualizan las firmas en UMAP y se resumen los scores por cluster para identificar qué poblaciones celulares presentan mayor respuesta a RETA o a programas HOXA/HSC.

Estructura del Repositorio

iHSC_transcriptomics

iHSC_transcriptomics
│
├── README.md                     # descripción del proyecto
├── .gitignore
├── LICENSE                       # MIT
│
├── referencias/
│   ├── REFERENCIAS.md            # referencias en texto
│   └── referencias.bib           # BibTeX
│
├── docs/
│   └── DATASETS_Ng_GSE232710.md  # cómo descargar/organizar los datos
│
├── data_raw/
│   ├── scRNAseq_Ng2025/          # aquí irán las matrices 10X del paper
│   └── GSE232710_bulk/           # aquí van GSE232710_RAW.tar y Series Matrix
│
├── data_processed/
│   └── (objetos ya procesados: .h5ad, .rds, matrices limpias…) (por hacer)
│
├── scripts/
│   ├── python/
│   │   ├── unpack_GSE232710.py   # descomprimir el RAW.tar
│   │   └── build_scRNAseq_h5ad.py # construye el .h5ad a partir de 10X
│   │                               # (hay que tener los datos preparados)
│   │
│   └── R/
│       ├── DESeq2_GSE232710_template.R
│       └── Seurat_iHSC_template.R
│
├── notebooks/
│   ├── 01_scRNAseq_iHSC_QC.ipynb        # QC + clustering + UMAP
│   ├── 02_bulk_GSE232710_DE.ipynb       # DESeq2 results + volcano/genes
│   └── 03_integration_sc_bulk.ipynb     # firmas bulk proyectadas en single-cell
│
└── results/
    ├── figures/          # UMAPs, volcano plots, heatmaps, etc
    ├── tables/           # TSV/CSV con DE, listas de genes, scores…
    └── models/           # objetos pesados

Este repositorio se organiza de la siguiente forma:

1. Un directorio principal con los archivos README.md, .gitignore, LICENSE
2. Una carpeta docs/ donde se documentan los datasets utilizados y notas metodológicas (DATASETS_Ng_GSE232710.md).
3. Una carpeta data_raw/ con subcarpetas para los datos brutos: (en .gitignore ahora mismo porque está vacía)
   • scRNAseq_Ng2025/ para matrices 10X u objetos crudos del scRNA-seq.
   • GSE232710_bulk/ para los archivos RAW y la Series Matrix del RNA-seq bulk.
4. Una carpeta data_processed/ donde se guardan los objetos ya procesados (por ejemplo, iHSC_scRNAseq_Ng2025_qc_norm.h5ad o archivos .rds).
5. Una carpeta scripts/ que contiene scripts en Python y R para:
   • Descargar/organizar datos (unpack_GSE232710.py, build_scRNAseq_h5ad.py).
   • Ejecutar análisis estadísticos (DESeq2_GSE232710_template.R, Seurat_iHSC_template.R).
6. Una carpeta notebooks/ que incluye cuadernos Jupyter para:
   • QC y clustering de scRNA-seq (01_scRNAseq_iHSC_QC.ipynb).
   • Análisis de expresión diferencial del bulk (02_bulk_GSE232710_DE.ipynb).
   • Integración de firmas bulk en scRNA-seq (03_integration_sc_bulk.ipynb).
7. Una carpeta results/ dividida en:
   • figures/ para las figuras generadas (UMAPs, volcano plots, heatmaps, etc.).
   • tables/ para tablas de resultados (DESeq2, listas de genes, scores por cluster).
   • models/ para objetos pesados (modelos entrenados u otros artefactos).
8. Una carpeta `referencias/' con los archivos utilizados como referencia para este repositorio

Limitaciones del estudio

Este análisis está sujeto a varias limitaciones, entre ellas:

1. Disponibilidad y formato de los datos de scRNA-seq: hasta que los datos de Ng et al. estén completamente accesibles, algunos pasos se basan en plantillas y supuestos sobre el formato 10X.
2. Calidad y homogeneidad de los datos bulk (GSE232710): diferencias en protocolos, tiempos de tratamiento y condiciones de cultivo pueden introducir ruido biológico y técnico.
3. Anotación de tipos celulares: la asignación de identidades celulares depende de marcadores conocidos y puede variar entre estudios. (es relativamente subjetiva)
4. Modelado simplificado: los modelos de integración (scorecards, module scores) capturan solo una parte de la complejidad regulatoria subyacente.

Autora del proyecto

Alejandra Martin Sevilla (diseño del repositorio, flujo de análisis y documentación).

@al3msvll

Alejandra trabajó con @JackyLi en @RetroBiosciences en este proceso y está interesada en utilizar estos datos para compararlos con sus propios datos. El repositorio está pensado como plantilla docente y base para futuros proyectos de análisis de datos hematopoyéticos derivados de iPSC.

Licencia

Este proyecto está pensado para ser distribuido bajo Licencia MIT. Eres libre de usar, modificar y distribuir este código, siempre que se incluya la nota de copyright y la declaración de la licencia.

Referencias

1. Ng ES, Sarila G, Li JY, Edirisnghe IS, et al. Long-term engrafting multilineage hematopoietic cells differentiated from human induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 2025;43(8):1274–1287.
2. Li JY, et al. GEO Series GSE232710: Bulk RNA-seq of PB BFP 3B5A supernatant under different retinoid treatments. Gene Expression Omnibus (GEO).
   Este repositorio se organiza de la siguiente forma: